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重大突破：外泌体miRNA或为Ⅰ型糖尿病患者带来新希望？

发表时间：2024-04-30 13:42

外泌体在细胞间传递蛋白质、mRNA和非编码RNA等分子方面发挥着关键作用，是细胞间通讯机制中的重要组成部分。近年来，随着生物医学领域的深入研究，外泌体已成为备受瞩目的研究热点。本次，我们将向您介绍一篇在《Cell Metabolism》杂志上发表的重要研究，该研究深入探讨了外泌体miRNA在Ⅰ型糖尿病发生与发展过程中的关键作用。让我们一同来解析这篇高分文章的研究策略与方法，共同探索这一领域的最新进展。

研究背景

Ⅰ型糖尿病，作为一种具有独特分子病理特征的自身免疫性疾病，其特点在于免疫细胞对胰岛的浸润以及胰岛β细胞的选择性清除。这一病理过程导致患者必须终身依赖胰岛素治疗，为生活带来诸多不便。为了探索新型治疗策略、预防疾病进展，深入研究胰岛β细胞与浸润性免疫细胞间的相互作用机制显得尤为关键。近期，美国的研究团队发现，T淋巴细胞能够通过释放含有miR-142-3p、miR-142-5p和miR-155的外泌体，作用于胰岛β细胞并促进其凋亡。这可能是Ⅰ型糖尿病产生发展机制的一部分。

首先，我们需要深入探讨和研究外泌体miRNA的相关策略。

1.目的基因筛选

先前，科研团队运用基因芯片技术对4周龄与8周龄的NOD小鼠（一种常用于Ⅰ型糖尿病研究的动物模型）的胰岛细胞进行了全面的miRNA表达谱分析。研究结果显示，与对照组相比，miR-142-3p/-5p、miR-150及miR-155的表达水平存在明显异常。这些miRNA虽然在免疫细胞功能调节中发挥着重要作用，但在胰岛细胞中的表达通常保持在较低水平。在本研究中，科研人员通过流式细胞仪精准分离出糖尿病前期的NOD小鼠胰岛β细胞，并对其进行深入检测。检测结果表明，在β细胞中，miR-142-3p/-5p与miR-155的表达水平显著上升（参见下图）。

在糖尿病前期NOD小鼠的胰岛β细胞中，我们发现miR-142-3p/-5p与miR-155的表达水平显著上升。免疫细胞对β细胞的部分负面效应是通过释放促炎症细胞因子来实现的。为了进一步验证这一机制，研究者将小鼠胰岛细胞暴露在促炎症细胞因子环境中，然而并未观察到miRNA表达水平的变化。这一结果提示我们，上述miRNA水平的增加并非由促炎症细胞因子直接引起。

2.外泌体分离与RNA鉴定

鉴于免疫细胞释放大量外泌体，研究者推测胰岛细胞内miR-142-3p/-5p与miR-155的水平增长与外泌体有关。为了验证这一假设，研究者采用了超速离心法，从人类Jurkat细胞（一种人T淋巴细胞系）和NOD小鼠T淋巴细胞中分别提取了外泌体（exoT和exoNOD）。随后，通过电镜观察、粒径分析以及特征蛋白分析等手段，对所提取的外泌体进行了严格的鉴定（如图所示），以确保其准确性和可靠性。

exoT与exoNOD的特征鉴定（A&B：电镜照片；C：外泌体特异性蛋白鉴定；D&E：外泌体粒径分析）

研究者利用qPCR技术对前述外泌体中的miRNA含量进行了验证，结果显示，这些由T淋巴细胞释放的外泌体中均含有miR-142-3p/-5p和miR-155。为了确认这些miRNA能够确实传递至胰岛β细胞，研究者将小鼠胰岛细胞与exoNOD共培养72小时，然后通过qPCR技术检测胰岛细胞内的miRNA水平。结果表明，miR-142-3p/-5p和miR-155的水平均发生了显著上升。为了进一步确认这些增加的miRNA是否来源于外泌体，研究团队利用人类miR-155与啮齿动物miR-155之间存在的单个碱基差异，将来自人类T淋巴细胞系的外泌体exoT与大鼠胰岛细胞共同孵育。接着，采用物种特异性的qPCR引物进行扩增，结果证实了大鼠胰岛细胞内增加的miR-155完全来自于人类T细胞的外泌体，而非内源性合成的mmu-miR-155。

胰岛细胞内上调的miRNA来源于外泌体

经过精心设计和周密实验，为探究miR-155是否以活性状态进入β细胞，科研人员构建了一套荧光素酶报告系统。他们选用鼠胰岛细胞系MIN6B1，将其转染至含有特定miR-155响应元件的荧光素酶报告系统中。随后，将转染后的细胞与exoT一同孵育，分别观察48小时和72小时后的荧光素酶活性变化。实验结果显示，荧光素酶活性显著降低（如图所示）。这一发现充分证实，miR-155确实以活性状态进入细胞，为深入了解其生物学功能和机制提供了有力依据。

荧光素酶报告系统显示miR-155以活性形式转运入细胞

3.miRNA功能研究

细胞凋亡试验

当大鼠胰岛细胞与外泌体（exoT）共同孵育时，胰岛细胞出现了明显的细胞凋亡现象。值得注意的是，这一现象可以被pan-caspase抑制剂zVAD所抑制，如图上所示。此外，当人类胰岛细胞与人血清中T细胞释放的外泌体（exo-hT）共同孵育时，也观察到了miR-142-3p/-5p和miR-155水平的上升，并伴随着细胞凋亡现象的加剧。这些结果为进一步探讨外泌体在胰岛细胞凋亡中的作用提供了重要依据。

（下图下）。

外泌体引发胰岛细胞凋亡

在后续的研究中，科研人员运用miRNA mimic技术，直接提升了大鼠胰岛细胞内miR-142-3p/-5p与miR-155的表达水平。实验结果显示，这些胰岛细胞均出现了凋亡现象（如图上所示）。为了深入探究这一现象背后的机制，研究团队进一步采用了anti-miR进行干预。anti-miR的主要作用是阻止被转运的miRNA发挥功能。实验表明，anti-miR并不会影响外泌体对miRNA的转运过程，但在miRNA进入胰岛细胞后，它能够捕获这些miRNA，从而抑制其生物活性的发挥。正如预期，当胰岛细胞被转染入anti-miR后，它们对由exoT引起的细胞凋亡产生了明显的抵抗作用。

miRNA效应蛋白筛选

4.miRNA作用机理研究

（1）靶基因筛选

为了深入研究T细胞外泌体诱导β细胞凋亡的机理，科研团队对经过exoNOD处理的小鼠胰岛细胞进行了RNA表达谱与信号通路的详尽分析。研究结果表明，与细胞因子（cytokine）及细胞趋化因子（chemokine）信号通路密切相关的蛋白表达水平出现上调，具体涉及Ccl2、Ccl7和Cxcl10等关键蛋白（参见附图）。此外，研究团队还尝试在小鼠胰岛细胞中直接过表达miR-142-3p/-5p与miR-155，并将人类胰岛细胞与人类T细胞外泌体（exo-hT）共同孵育。这些实验同样观察到Ccl2、Ccl7和Cxcl10的蛋白水平出现上调，从而进一步验证了初步的发现。

miRNA效应蛋白筛选

（2）信号通路鉴定

经研究表明，NF-κB信号通路的激活能够导致Ccl2、Ccl7和Cxcl10等蛋白的表达水平发生变化，并启动胰岛β细胞的凋亡过程。为了验证T淋巴细胞外泌体是否对胰岛细胞的NF-κB信号通路产生激活作用，研究人员将鼠胰岛细胞系MIN6B1与外泌体exoT共同孵育，观察到NF-κB向细胞核转移的现象（如图左侧所示），这表明该因子已被激活。当向细胞中转入miR-142-3p/-5p与miR-155 mimics后，同样观察到了类似的转定位效应（如图右侧所示）。值得注意的是，实验中观察到的NF-κB转定位与细胞在暴露于促炎症细胞因子后产生的效应极为相似，这进一步证实了T淋巴细胞外泌体能够激活胰岛细胞的NF-κB信号通路。

NF-κB的转定位效应

5.动物实验验证

经过上述研究初步表明，在Ⅰ型糖尿病的发病初期，当免疫细胞浸润至胰岛β细胞时，一组从免疫细胞传递到β细胞的miRNA可能会对疾病的进程产生关键性影响。为了验证这一推测，研究团队利用腺病毒载体技术，精心设计了一个包含胰岛素启动子、绿色荧光蛋白（GFP）以及针对miR-142-3p/-5p、miR-150、miR-155的结合位点的“miRNA海绵”表达载体（如图左所示）。随后，将这一载体通过腹腔注射的方式导入8周龄的NOD小鼠体内。结果显示，载体能够按照预期在胰岛β细胞内特异性表达。当这些小鼠生长至32周龄时，那些未接受载体注射的对照组NOD小鼠中有80%发展成为了糖尿病患者，而接受了“miRNA海绵”注射的小鼠群体中，糖尿病的发病率降低至40%。